Duisburg liegt am Zusammenfluss von Rhein und Ruhr. Wasser und Industrie haben den Charakter der Stadt geprägt. Mit dem größten Binnenhafen der Welt ist Duisburg bis heute ein zentrales Logistikdrehkreuz in Europa. Stadtteile wie Marxloh und Bruckhausen zeugen von der industriellen Vergangenheit der Stadt. Zugleich zeigt der Landschaftspark Duisburg-Nord, ein ehemaliges Hüttenwerk, das heute als öffentlicher Park genutzt wird, wie sich solche Standorte für Erholung und Kultur neu nutzen lassen. Zum kulturellen Leben Duisburgs gehören unter anderem das Lehmbruck Museum mit seiner bedeutenden Skulpturensammlung und das Museum Küppersmühle, das zeitgenössische Kunst in einem umgenutzten Industriebau zeigt. Im Theater Duisburg spielt die Deutsche Oper am Rhein. Das filmforum Duisburg am Dellplatz beherbergt neben einem historischen Filmarchiv ein regelmäßiges Kinoprogramm sowie die Duisburger Filmwoche.

Essen, einst das Herzstück der deutschen Kohle- und Stahlindustrie, hat sich zu einer Stadt gewandelt, die sowohl für ihre Kultur als auch für ihre Grünflächen bekannt ist. Dieser Wandel spiegelt sich in Sehenswürdigkeiten wie dem UNESCO-Welterbe Zollverein und der Villa Hügel, dem ehemaligen Wohnsitz der Familie Krupp, sowie in Parks und am Baldeneysee wider. Zu den bedeutendsten kulturellen Einrichtungen der Stadt zählen das Museum Folkwang, das Aalto-Theater, die Philharmonie Essen und das Grillo-Theater sowie zeitgenössische Institutionen wie PACT Zollverein und das Ruhr Museum. Die Manifesta 16 Ruhr setzt sich an drei Veranstaltungsorten mit Essens architektonischem Erbe der Nachkriegszeit auseinander: im Stadtzentrum, in Karnap und in Frohnhausen.

Gelsenkirchen war einst Zentrum des europäischen Kohlebergbaus. Der nächtliche Feuerschein seiner Kokereien brachte ihm den Beinamen „Stadt der tausend Feuer“ ein. Heute zeugen die Zeche Nordstern und das Musiktheater im Revier (MiR) vom Wandel der Stadt. Aus Halden und stillgelegten Bahntrassen sind Parks und Aussichtspunkte geworden. Industrie, Migration und Erneuerung prägen Gelsenkirchens Stadtteile und Communities bis heute. Die Manifesta 16 Ruhr richtet ihren Fokus auf Wohnviertel und die charakteristischen „Pantoffelkirchen“ – Quartierskirchen, die einst dort entstanden, wo Arbeiter*innen und ihre Familien lebten. Die Zentrale der Biennale befindet sich im ehemaligen Pfarrhaus von St. Josef in Ückendorf.

Bochum ist eines der Zentren für Forschung, Kultur und Bildung im Ruhrgebiet. Über sein industrielles Erbe hinaus prägen heute Stadtteile das Bild, die den fortwährenden sozialen und wirtschaftlichen Wandel der Region widerspiegeln. Die Kulturlandschaft reicht vom Deutschen Bergbau-Museum und der Jahrhunderthalle – zentraler Spielort der Ruhrtriennale – über die Ruhr-Universität bis zum Schauspielhaus Bochum und dem Kunstmuseum Bochum. Die Manifesta 16 Ruhr richtet ihren Fokus auf vier Kirchen in Wohnvierteln, die von Migration, wirtschaftlichem Wandel und sich wandelnden sozialen Strukturen geprägt sind. Die Biennale findet an vier Orten in Bochum statt, darunter eine Notkirche aus der Nachkriegszeit und eine historische Kulturkirche im ehemaligen Arbeiterviertel Goldhamme.